早期，研究者在做 siRNA 转染实验时，市面上还没有专门针对siRNA 转染的试剂产品， 因此，常常只能选择 lipofectamine2000 、 lipofectamine3000 等主要针对质粒 DNA 转染的试剂来进行 siRNA 转染实验，这些转染试剂确实能对部分细胞进行有效的siRNA 转染，但在很多细胞的 siRNA 转染效果上，却表现平平，并且细胞毒性很大，这就是为人熟知的第一代 siRNA 转染试剂。随着 RNAi 技术的应用越来越多和 siRNA 转染实验的广泛开展，第二代新型siRNA 转染试剂随之问世，其主要代表产品为中外合资公司百代生物的 RFect V2 和赛默飞的 lipofectamine RANiMAX。

　　相较于第一代 siRNA 转染试剂，第二代产品的优势明显，尤其是在 siRNA 转染的效率上有了非常显著的提升，并且试剂成分更加温和，细胞毒性更低，非常适合于siRNA 转染实验。接下来我们就从以下几方面来深度剖析一下两代试剂的差别：

　　一、从质粒和 siRNA 的结构以及作用机制上分析质粒和 siRNA 转染试剂的不通用性

　　以 lipofectamine2000 、lipofectamine3000 为代表的第一代 siRNA转染试剂，其实主要为转染质粒 DNA 而研发。我们都知道，质粒 DNA和 siRNA 在结构上就相差甚远，就大小而言，质粒一般可达数千碱基对，而 siRNA 通常只有 21 个碱基对。并且，从结构稳定性上来说，质粒 DNA 较为稳定，而 siRNA 作为核糖核苷酸比脱氧核糖核苷酸更容易被降解，极不稳定。所以，质粒和 siRNA 本就是两种大相径庭

　　的物质。除了这些结构上的差异，两者的作用机制也存在巨大区别，质粒 DNA 作用在细胞核，目的是使基因过表达，而 siRNA 作用于细胞质，目的是敲降或干扰某个目的基因的表达。因此，综上两方面原因，DNA 和 siRNA 的转染试剂并不通用，尽管这些一代转染试剂可以在一定程度上进行 siRNA 的转染，甚至是实现 siRNA 和 DNA 的共转染，但是对于单独 siRNA 的转染效果并不理想。而 RFect V2 和lipofectamine RANiMAX 等二代试剂针对性更强，在 siRNA 转染上做到了真正意义上的专业，不仅为 siRNA 转染降低了试剂的毒性，并且显著提高了siRNA 转染的效率。

　　二、从成分和毒性上分析为何第二代 siRNA 转染试剂更适合 siRNA转染

　　siRNA 转染比质粒转染对转染试剂的细胞毒性要求更为严格，主要是由于转染试剂的毒性往往是造成众多基因的表达水平直接或间接下调的原因，这对于一些过量表达的质粒转染实验来说，影响不大，但在以研究基因干扰为主要目的的RNAi 实验来说，就是致命的，因为细胞死亡和 RNAi 实验造成的结果在现象上是一致的，轻则影响实验数据，重则改变实验结果。因此，siRNA 实验首先要求选择适合小核酸的高效转染试剂，其次要求转染试剂本身的细胞毒性很小。而第一代 siRNA 转染试剂的研发材料普遍以阳离子脂质体或聚乙烯亚胺（PEI）为主，这两类成分对细胞来说毒性是比较大的。并且由于第一代试剂更适用于质粒转染，且带有高电荷强度，这也在一定程度增加了细胞毒性，也就不难解释为什么很多研究者反映在一些耐受能力

　　弱的细胞中会引起细胞严重死亡，尤其是对于原代细胞的转染。

　　那么，第二代 siRNA 转染试剂在成分和毒性上有哪些优势呢？随着基因干扰技术的不断发展，专门适用于siRNA 转染的试剂应运而生，以 RFect V2 和 RNAiMAX 为主的二代 siRNA 转染试剂，在成分上进行了优化与升级。RANiMAX 虽仍是阳离子脂质体成分，但和lipofectamine2000/3000 相比，对细胞的作用温和了很多，细胞死亡率大概只有 10% ，是专门为 siRNA 转染设计研发的；而 RFect V2 的成分为新型的可降解生物纳米材料，研发者在研发时就从源头极大限度的降低了试剂的毒性，并且这种成分能够在进入细胞后自身很快进行代谢降解，来确保 siRNA 得到充分释放，其毒性之低甚至可用于siRNA 药物研发。根据我们实验室的数据，空白组（即正常培养的细胞对照组）和用RFect V2 进行转染的实验组细胞死亡率几乎一致，也就是说 RFect V2 对细胞的毒性极低，并且为了进一步验证其细胞毒性，我们在原代大鼠主动脉平滑肌细胞上进行了小核酸 NC-FAM的转染。实验结果显示，RFect V2 几乎没有引起细胞死亡，对小核酸NC-FAM 的转染阳性率在该细胞中可达 90%以上，这是一代试剂所无法达到的 siRNA 转染效果。

　　三、从转染效率上分析两代 siRNA 转染试剂的性能差异

　　一代试剂在研发最初是为了更好的包裹分子量较大的质粒 DNA，所以运用了极高的电荷强度将 DNA 转入细胞。确实，一些案例和实验数据证明，这种高电荷强度的试剂在一定程度上能够进行 siRNA转染，但往往转染效果无法达到最佳，原因是被转入的 siRNA 无法得到完全释放以至于不能充分发挥作用，这也就是为什么很多研究者反映明明镜下荧光点很多很亮，但一做 qPCR 却发现基因沉默效率很低的原因。

　　区别于第一代产品，第二代 siRNA 转染试剂是专门为转染 siRNA、 miRNA mimics 、miRNA inhibitor 等这类小分子核酸研发的，针对性更强的同时，能够使 siRNA 得到最大程度的转染和胞内释放，以下是 RFect V2 和 RNAiMAX 两款 siRNA 转染试剂转 FAM-NC 到 Hela细胞的荧光图，转染阳性率均可达到 90%以上（图 a 、b）。

　　同时，为了进一步对比两代 siRNA 转染试剂的转染效率，我们将两款一代试剂和 RFect V2、RNAiMAX 进行了基因沉默效率的比较，在同步转染 siLamin A/C 到 Hela 后，24h 对不同实验组进行细胞收集，

　　RT-qPCR 检测结果显示 RFect V2、RNAiMAX 两款试剂的敲低效率最高，对 Lamin A/C 基因敲低效率均在 90%以上（图 c），可见第二代siRNA 转染试剂能够进行高效转染 siRNA 的同时，也能获得理想的对目的基因的敲降效果。

　　图c. 不同siRNA 转染试剂转染siLamin A/C 到Hela 细胞后，24h， Lamin A/C 基因mRNA 表达水平的比较。